詳細介紹
囊胚注射是將基因修飾后的胚胎干細胞(ES細胞)注入囊胚期胚胎(發育約3.5天的小鼠胚胎),通過嵌合體培育獲得基因修飾動物模型的技術。其核心機制包括:
嵌合體形成:外源ES細胞與宿主囊胚內細胞團(ICM)融合,共同發育為嵌合體后代。
生殖系傳遞:ES細胞分化為生殖細胞,實現基因修飾的遺傳(需嵌合率>60%)。
時空窗口:囊胚期胚胎細胞分化程度低,且囊腔結構便于顯微操作。
生物學基礎:
囊胚由外層滋養層細胞(發育為胎盤)和內細胞團(發育為胎兒)構成,注射靶向ICM區域確保ES細胞參與胚胎發育。
步驟 | 關鍵操作與參數 |
---|---|
ES細胞制備 | 需多能性驗證(如Oct4表達),常用129品系或C57BL/6遺傳背景ES細胞 |
囊胚供體鼠處理 | 超排卵:PMSG(5IU)→ hCG(5IU)→ 與雄鼠合籠 → 取見栓后2.5天的囊胚(8細胞期胚胎培養過夜獲得) |
顯微注射系統校準 | 注射針內徑10-15μm,單次注入10-15個ES細胞 |
存活率控制:注射后囊胚存活率需>90%,移植胚胎數≥10枚/受體鼠。
嵌合體鑒定:
毛色嵌合:ES細胞(如129-agouti)與宿主囊胚(如C57BL/6黑色)毛色差異直觀判斷嵌合率。
基因型驗證:PCR檢測外源基因或熒光標記(如GFP)。
高嵌合體篩選:選擇毛色嵌合>70%的雄性嵌合鼠。
生殖系傳遞:嵌合鼠與野生型交配 → F1代基因型檢測 → 建立純合品系。
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