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胞質(zhì)注射實(shí)驗(yàn)

簡(jiǎn)要描述:胞質(zhì)注射實(shí)驗(yàn)是一種將外源物質(zhì)(如mRNA、蛋白質(zhì)或其他分子)直接注入細(xì)胞質(zhì)中的顯微操作技術(shù),常用于早期胚胎或卵母細(xì)胞。與注入細(xì)胞核不同,胞質(zhì)注射主要用于實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)或功能干預(yù),避免對(duì)基因組造成yong久性改變。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因功能研究、胚胎發(fā)育機(jī)制探索以及輔助生殖等領(lǐng)域。

  • 更新時(shí)間:2025-07-10
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詳細(xì)介紹

一、技術(shù)定義與核心原理

胞質(zhì)注射是顯微注射技術(shù)的一種,通過顯微操作系統(tǒng)將外源基因直接注入細(xì)胞質(zhì)(而非細(xì)胞核),實(shí)現(xiàn)基因?qū)搿F浜诵臋C(jī)制包括:

  1. 非整合性表達(dá):外源DNA以游離體形式存在,通過細(xì)胞自身轉(zhuǎn)錄機(jī)制表達(dá),不整合至宿主基因組(區(qū)別于原核注射的隨機(jī)整合)。

  2. 適用性廣:可操作單細(xì)胞(如原代細(xì)胞、干細(xì)胞)及多細(xì)胞胚胎(如2細(xì)胞期胚胎)。

  3. 瞬時(shí)表達(dá)為主:外源基因隨細(xì)胞分裂逐漸丟失,表達(dá)周期較短(通常<72小時(shí))。

生物學(xué)基礎(chǔ)
依賴細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶完成外源基因表達(dá),無(wú)需核定位信號(hào)(NLS)介導(dǎo)。


二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

(一)設(shè)備與材料準(zhǔn)備

組件參數(shù)要求功能說(shuō)明引用來(lái)源
顯微操作系統(tǒng)微操縱器精度0.1μm,注射針內(nèi)徑<0.5μm精準(zhǔn)控制注射位置與深度
外源DNA溶液濃度1-5 ng/μL,溶于低離子強(qiáng)度緩沖液(如TE)減少細(xì)胞毒性,提升表達(dá)效率
靶細(xì)胞類型原代角質(zhì)形成細(xì)胞、HEK-293T、早期胚胎等需具備較強(qiáng)DNA攝取與表達(dá)能力

(二)操作步驟

  • 關(guān)鍵參數(shù)

    • 注射壓力:5-10 hPa(過高導(dǎo)致細(xì)胞破裂)。

    • 注射時(shí)長(zhǎng):?jiǎn)渭?xì)胞≤30秒,避免細(xì)胞脫水。

  • 存活率控制:熟練操作下細(xì)胞存活率>80%,胚胎存活率>70%。

(三)表達(dá)驗(yàn)證方法

  1. 熒光標(biāo)記法

    • 注射含GFP/RFP報(bào)告基因的載體,24小時(shí)后熒光顯微鏡觀察。

  2. 蛋白檢測(cè)法

    • Western Blot或免疫組化檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)。


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