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原核注射是將外源DNA直接注入受精卵的雄性原核(體積較大且易定位),使外源基因隨機整合至宿主基因組的技術。其核心機制包括:
隨機整合:外源DNA通過非同源末端連接(NHEJ)插入染色體,整合位點與拷貝數不可控。
原核優勢:雄性原核(由精子形成)比雌性原核更易定位,且DNA修復活性高。
瞬時表達窗口:受精卵處于單細胞期,DNA修復系統活躍,利于外源片段整合。
生物學基礎:
受精后12-24小時為最佳操作窗口(小鼠),此時原核清晰可見。
步驟 | 關鍵操作與參數 |
---|---|
載體構建 | 線性化載體(避免質粒骨架整合) + 必需元件(啟動子、編碼區、polyA) |
受精卵獲取 | 超排卵處理雌鼠(PMSG/hCG)→ 與雄鼠合籠→ 取見栓后0.5天的受精卵 |
顯微注射系統校準 | 注射針內徑1-2μm,壓力5-10 hPa,單次注射體積2pL(含1-2ng DNA) |
存活率控制:注射后受精卵存活率需>80%。
移植時機:發育至2細胞期再移植,可提高著床率。
基因型檢測:
PCR法:提取鼠尾DNA,擴增外源基因。
Southern Blot:驗證拷貝數與整合完整性。
表達驗證:
Western Blot(蛋白水平)或RT-PCR(轉錄水平)。
首建鼠特性:
每只Founder為獨立品系(因隨機整合位點不同),需分別建系。
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