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原核注射實驗

簡要描述:原核注射實驗是一種將外源DNA直接注入受精卵原核(通常為雄原核)中的轉基因技術,用于制備轉基因動物模型。注射后,外源基因可隨機整合到宿主基因組中,并在后續發育中穩定遺傳。該方法操作簡便、效率較高,是構建轉基因小鼠等模式生物的常用手段,廣泛應用于基因功能研究、疾病模型建立及藥物開發等領域。

  • 更新時間:2025-07-10
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詳細介紹

一、技術定義與核心原理

原核注射是將外源DNA直接注入受精卵的雄性原核(體積較大且易定位),使外源基因隨機整合至宿主基因組的技術。其核心機制包括:

  1. 隨機整合:外源DNA通過非同源末端連接(NHEJ)插入染色體,整合位點與拷貝數不可控。

     
  2. 原核優勢:雄性原核(由精子形成)比雌性原核更易定位,且DNA修復活性高。

  3. 瞬時表達窗口:受精卵處于單細胞期,DNA修復系統活躍,利于外源片段整合。

生物學基礎
受精后12-24小時為最佳操作窗口(小鼠),此時原核清晰可見。


二、標準化操作流程

(一)前期準備

步驟關鍵操作與參數
載體構建線性化載體(避免質粒骨架整合) + 必需元件(啟動子、編碼區、polyA)
受精卵獲取超排卵處理雌鼠(PMSG/hCG)→ 與雄鼠合籠→ 取見栓后0.5天的受精卵
顯微注射系統校準注射針內徑1-2μm,壓力5-10 hPa,單次注射體積2pL(含1-2ng DNA)

(二)注射與胚胎移植

  • 存活率控制:注射后受精卵存活率需>80%。

  • 移植時機:發育至2細胞期再移植,可提高著床率。

(三)首建鼠(Founder)鑒定

  1. 基因型檢測

    • PCR法:提取鼠尾DNA,擴增外源基因。

    • Southern Blot:驗證拷貝數與整合完整性。

  2. 表達驗證

    • Western Blot(蛋白水平)或RT-PCR(轉錄水平)。

首建鼠特性
每只Founder為獨立品系(因隨機整合位點不同),需分別建系。


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