DTA（Diphtheria Toxin A）負(fù)篩選基因是一種常用的遺傳工程工具，主要用于剔除未發(fā)生特定重組事件的細(xì)胞。這種技術(shù)依賴于白喉毒素A鏈（DTA），它能抑制蛋白質(zhì)合成并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在基因打靶實(shí)驗(yàn)中，DTA通常被用來作為負(fù)篩選標(biāo)記，以確保只有那些經(jīng)歷了正確同源重組的細(xì)胞才能存活下來。

DTA負(fù)篩選的工作原理

• 作用機(jī)制：DTA編碼的是白喉毒素的一個(gè)亞單位，該毒素能夠阻斷真核生物中的蛋白質(zhì)合成過程。當(dāng)DTA表達(dá)時(shí)，它可以殺死含有它的細(xì)胞，除非這些細(xì)胞具備抵抗此毒性的能力。

• 應(yīng)用背景：在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物或細(xì)胞系的過程中，研究人員常常需要篩選出發(fā)生了精確DNA整合的細(xì)胞。為了做到這一點(diǎn)，除了使用正篩選標(biāo)記如neo等來選擇成功導(dǎo)入外源DNA的細(xì)胞之外，還會利用到DTA這樣的負(fù)篩選標(biāo)記來淘汰那些沒有正確整合目標(biāo)DNA的細(xì)胞。

DTA負(fù)篩選的應(yīng)用

• 在CRISPR-Cas9介導(dǎo)的全基因組敲除文庫篩選中，DTA可以與TK（胸苷酸激酶）一起用作報(bào)告系統(tǒng)的一部分，幫助識別參與天然免疫信號通路調(diào)控的關(guān)鍵宿主基因。

• 通過將DTA置于特定啟動子控制之下，比如IFNβ啟動子區(qū)域的最佳截短版本，可以在病毒感染后誘導(dǎo)EGFP或者zi殺基因TK和DTA的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對相關(guān)基因的功能性篩選。

使用DTA負(fù)篩選的優(yōu)勢

• 提高特異性：由于DTA能夠有效清除不希望出現(xiàn)的隨機(jī)整合事件，因此它有助于增加最終獲得的目標(biāo)克隆群體中的正確重組體比例。

• 增強(qiáng)效率：結(jié)合其他篩選方法（例如G418抗性篩選），DTA負(fù)篩選可以幫助快速縮小候選細(xì)胞株范圍，減少后續(xù)分析所需的工作量。