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細胞轉染技術

更新時間:2022-05-19      點擊次數:1985

一、細胞轉染

 細胞轉染是指將外源分子如DNA,RNA等導入真核細胞的技術。常規轉染技術可分為瞬時轉染穩定轉染兩大類。本實驗室主要是質粒轉染miRcroRNA轉染慢病毒轉染藥物轉染多肽轉染等。

二、miRcroRNA轉染

(一)實驗材料及試劑

        六孔板、CO2培養箱、EP管、酒精燈等;無血清培養基、MEM-α或DMEM、RNA、lipofectamine 2000、MSC細胞等。

(二)實驗內容

1當六孔板中MSC細胞密度達90%時,準備轉染,將無血清培養基、MEM-α或DMEM取出復溫并注意平衡好;

2取出細胞,將培養基換成無血清培養基,放回孵箱培養;

3取滅菌的EP管,按要求混好RNA(約100pmol/孔),每管250ul DMEM,混勻;

4另取EP管,加入lipofectamine 2000(5 ul/孔)和MEM-α或DMEM(250ul/孔),輕輕混勻后室溫靜置5min;

5將上述兩個EP管混勻;

6室溫靜置20min,將lipofectamine 2000-質粒混合液滴到六孔板中,500ul/孔;

7將細胞放回孵箱培養,4h后換回含血清的*培養基。

(三)注意事項

1轉染的時候培養基中不能添加抗生素。抗生素,比如青霉素和鏈霉素,一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導致轉染效率低。所以,在轉染培養基中不能使用抗生素。

2如果在無血清條件下轉染,使用含血清的正常生長培養基進行細胞鋪板。在加入復合物前移去生長培養基,替換為0.5mL無血清培養基。

3在37℃,5%的CO2中保溫24-48小時,無須去掉復合物或更換培養基或者在4-5小時后更換生長培養基也不會降低轉染活性。


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