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慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

簡(jiǎn)要描述:慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是一種利用改造后的慢病毒載體將外源基因穩(wěn)定導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒,具有感染分裂和非分裂細(xì)胞的能力,能將目的基因整合到宿主基因組中,實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因功能研究、基因治療和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的制備等領(lǐng)域。

  • 更新時(shí)間:2025-07-10
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詳細(xì)介紹

一、技術(shù)定義與核心價(jià)值

慢病毒轉(zhuǎn)染是利用改造后的慢病毒載體將外源基因遞送至靶細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的基因?qū)爰夹g(shù)。其核心優(yōu)勢(shì)包括:

  1. 廣譜細(xì)胞適用性:可感染分裂細(xì)胞與非分裂細(xì)胞(如神經(jīng)元、干細(xì)胞、原代細(xì)胞),突破傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染限制 。

  2. 高效整合表達(dá):病毒RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為DNA后整合至宿主基因組,實(shí)現(xiàn)外源基因的yong久性表達(dá) 。

  3. 低免疫原性:刪除病毒致病基因(如HIV的 tatrev),顯著降低宿主免疫反應(yīng) 。

  4. 操作便捷性:無(wú)需復(fù)雜轉(zhuǎn)染試劑,通過(guò)病毒顆粒直接感染細(xì)胞 。

術(shù)語(yǔ)辨析

  • 轉(zhuǎn)染(Transfection) :通常指非病毒介導(dǎo)的核酸導(dǎo)入(如電穿孔、脂質(zhì)體)。

  • 轉(zhuǎn)導(dǎo)(Transduction) :特指病毒介導(dǎo)的基因傳遞,慢病毒技術(shù)屬于此類 。


二、分子機(jī)制:從病毒包裝到基因整合

(一)慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)成

組分功能技術(shù)演進(jìn)
轉(zhuǎn)移質(zhì)粒攜帶外源基因(如cDNA、shRNA)及包裝信號(hào)(Ψ)第三代載體刪除 tat,改用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄 
包裝質(zhì)粒表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白(Gag、Pol)分割為gag/pol與rev兩質(zhì)粒,降低重組風(fēng)險(xiǎn) 
包膜蛋白質(zhì)粒表達(dá)VSV-G蛋白(水皰性口炎病毒G蛋白),決定宿主范圍替代HIV天然包膜,擴(kuò)大感染細(xì)胞類型 
輔助質(zhì)粒提供Rev蛋白,促進(jìn)未剪接RNA出核增強(qiáng)病毒產(chǎn)量 

(二)宿主細(xì)胞內(nèi)的基因遞送流程

  1. 病毒進(jìn)入:VSV-G蛋白結(jié)合靶細(xì)胞膜受體(如LDLR),介導(dǎo)膜融合 。

  2. 逆轉(zhuǎn)錄與入核:病毒RNA在胞質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,經(jīng)整合前復(fù)合體(PIC)轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi) 。

  3. 基因組整合:病毒整合酶(Integrase)將cDNA隨機(jī)插入宿主染色體,實(shí)現(xiàn)yong久性表達(dá) 。


三、標(biāo)準(zhǔn)操作流程與技術(shù)優(yōu)化

(一)病毒包裝與純化(以293T細(xì)胞為例)

步驟操作要點(diǎn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染四質(zhì)粒系統(tǒng)(轉(zhuǎn)移+包裝+包膜+輔助)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48-72小時(shí)收集上清 質(zhì)粒純度>1.8(A260/A280),無(wú)內(nèi)毒素 
病毒濃縮超速離心(50,000×g)或PEG沉淀法,提高滴度10-100倍 濃縮后滴度>1×10? IFU/mL 
滴度測(cè)定流式細(xì)胞術(shù)(熒光報(bào)告基因)或qPCR(病毒基因組拷貝數(shù)) 功能性滴度(TU/mL)>10?為合格 

(二)靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選

  1. 感染條件優(yōu)化

    • 添加聚凝胺(Polybrene,8μg/mL)增強(qiáng)病毒吸附 。

    • 感染復(fù)數(shù)(MOI)測(cè)試:通常MOI=5-20(根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整) 。

       
  2. 穩(wěn)定株篩選

    • 抗生素篩選:嘌呤霉素(1μg/mL)處理7-14天,清除未轉(zhuǎn)染細(xì)胞 。

    • 單克隆擴(kuò)增:有限稀釋法獲得均一性細(xì)胞株 。

關(guān)鍵技巧

  • 非分裂細(xì)胞(如神經(jīng)元)需延長(zhǎng)感染時(shí)間至72小時(shí) 。

  • 原代細(xì)胞建議使用低MOI(≤5)避免毒性 。


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