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簡要描述:基因編輯陽性細胞篩選是指在基因編輯實驗(如CRISPR/Cas9)后,通過特定方法識別和分離出成功發(fā)生目標(biāo)基因修飾的細胞。常用的篩選方法包括抗生素篩選(如利用抗性基因標(biāo)記)、熒光蛋白標(biāo)記篩選、PCR或測序驗證等。這一過程對于獲得純合或雜合突變細胞系、研究基因功能或進行疾病模型構(gòu)建至關(guān)重要。
詳細介紹
陽性細胞篩選是基因編輯的核心環(huán)節(jié),其效率直接影響實驗周期與成功率。
核心目標(biāo)
從混合細胞群中分離成功編輯的細胞(如基因敲除/KO、敲入/KI)。
排除野生型細胞干擾(未編輯細胞占比高時,易導(dǎo)致假陰性)。
關(guān)鍵挑戰(zhàn)
細胞損傷:長期篩選導(dǎo)致細胞老化(豬成纖維細胞傳代后增殖能力驟降)。
假陽性風(fēng)險:部分編輯未wan全破壞基因功能(如移碼突變未致功能喪失)。
通量瓶頸:傳統(tǒng)單克隆培養(yǎng)需22天以上,且陽性率不足20%。
利用修復(fù)機制觸發(fā)熒光/抗性標(biāo)記表達,實現(xiàn)可視化和快速分選:
修復(fù)機制 | 報告系統(tǒng)設(shè)計 | 篩選方法 | 優(yōu)勢 | 案例 |
---|---|---|---|---|
NHEJ | 靶向破壞熒光蛋白終止子→恢復(fù)表達 | FACS分選GFP?細胞 | 直觀高效,適用于KO | CRISPR-DIY載體 |
HDR | 同源重組插入抗性基因(如Puro?) | 抗生素壓力篩選 | 適合KI,成本低 | 碧云天CRISPR質(zhì)粒 |
SSA | 斷裂誘導(dǎo)單鏈退火修復(fù)→熒光蛋白重構(gòu) | 流式細胞術(shù) | 靈敏度高,脫靶率低 | 多重基因編輯驗證 |
操作流程(以NHEJ-GFP系統(tǒng)為例):
構(gòu)建含GFP-TAA終止子的編輯載體(sgRNA靶向TAA區(qū)域)。
轉(zhuǎn)染細胞后,NHEJ修復(fù)破壞終止子→GFP表達。
72h后使用流式細胞儀(如iQue®)分選GFP?細胞。
突破性方案:僅需50個細胞即可完成基因型鑒定,縮短周期15天以上。
關(guān)鍵參數(shù):
細胞量:≥50個(20細胞組檢出率不足,P<0.01)。
酶切靈敏度:T7E1可檢測≥5%的編輯效率。
驗證步驟:Sanger測序確認突變類型(如插入/缺失)。
方法 | 原理 | 適用場景 | 局限 |
---|---|---|---|
T7E1酶切 | 錯配切割產(chǎn)生異源雙鏈 | 初篩(低成本) | 靈敏度低(≥5%編輯率) |
Sanger測序 | 直接讀取序列變異 | 單克隆驗證 | 通量低 |
高通量測序 | 深度覆蓋靶位點突變 | 多基因/脫靶分析 | 成本高 |
操作優(yōu)化:
混合克隆預(yù)篩:FA-PCR檢測群體編輯率,>30%時再分選單克隆。
雙驗證策略:T7E1初篩陽性克隆 → Sanger測序確認(避免假陽性)。
細胞類型 | 推薦方法 | 理由 |
---|---|---|
原代細胞 | 微量細胞鑒定法 | 避免長期培養(yǎng)致老化(豬成纖維細胞) |
腫瘤細胞系 | 抗生素篩選 + FACS | 增殖快,耐藥性穩(wěn)定 |
iPSCs | HDR報告系統(tǒng) + 單克隆測序 | 維持多能性,需高精度編輯 |
編輯類型 | 篩選技術(shù) | 關(guān)鍵指標(biāo) |
---|---|---|
基因敲除(KO) | NHEJ-GFP報告系統(tǒng) | GFP?細胞占比(流式定量) |
基因敲入(KI) | 抗生素篩選 + PCR驗證 | 抗性存活率 + 側(cè)翼序列擴增 |
點突變(PM) | T7E1 + 深度測序 | 突變頻率>90% |
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