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基因編輯陽性細胞篩選

簡要描述:基因編輯陽性細胞篩選是指在基因編輯實驗(如CRISPR/Cas9)后,通過特定方法識別和分離出成功發(fā)生目標(biāo)基因修飾的細胞。常用的篩選方法包括抗生素篩選(如利用抗性基因標(biāo)記)、熒光蛋白標(biāo)記篩選、PCR或測序驗證等。這一過程對于獲得純合或雜合突變細胞系、研究基因功能或進行疾病模型構(gòu)建至關(guān)重要。

  • 更新時間:2025-07-10
  • 瀏覽次數(shù):18

詳細介紹

基因編輯陽性細胞篩選:技術(shù)策略與優(yōu)化流程

陽性細胞篩選是基因編輯的核心環(huán)節(jié),其效率直接影響實驗周期與成功率。


一、篩選目標(biāo)與挑戰(zhàn)

  1. 核心目標(biāo)

    • 從混合細胞群中分離成功編輯的細胞(如基因敲除/KO、敲入/KI)。

    • 排除野生型細胞干擾(未編輯細胞占比高時,易導(dǎo)致假陰性)。

  2. 關(guān)鍵挑戰(zhàn)

    • 細胞損傷:長期篩選導(dǎo)致細胞老化(豬成纖維細胞傳代后增殖能力驟降)。

    • 假陽性風(fēng)險:部分編輯未wan全破壞基因功能(如移碼突變未致功能喪失)。

    • 通量瓶頸:傳統(tǒng)單克隆培養(yǎng)需22天以上,且陽性率不足20%。


二、主流篩選技術(shù)及操作流程

(一)基于報告系統(tǒng)的富集技術(shù)

利用修復(fù)機制觸發(fā)熒光/抗性標(biāo)記表達,實現(xiàn)可視化和快速分選:

修復(fù)機制報告系統(tǒng)設(shè)計篩選方法優(yōu)勢案例
NHEJ靶向破壞熒光蛋白終止子→恢復(fù)表達FACS分選GFP?細胞直觀高效,適用于KOCRISPR-DIY載體
HDR同源重組插入抗性基因(如Puro?)抗生素壓力篩選適合KI,成本低碧云天CRISPR質(zhì)粒
SSA斷裂誘導(dǎo)單鏈退火修復(fù)→熒光蛋白重構(gòu)流式細胞術(shù)靈敏度高,脫靶率低多重基因編輯驗證

操作流程(以NHEJ-GFP系統(tǒng)為例):

  1. 構(gòu)建含GFP-TAA終止子的編輯載體(sgRNA靶向TAA區(qū)域)。

  2. 轉(zhuǎn)染細胞后,NHEJ修復(fù)破壞終止子→GFP表達。

  3. 72h后使用流式細胞儀(如iQue®)分選GFP?細胞

(二)微量細胞快速鑒定法

突破性方案:僅需50個細胞即可完成基因型鑒定,縮短周期15天以上。

關(guān)鍵參數(shù)

  • 細胞量:≥50個(20細胞組檢出率不足,P<0.01)。

  • 酶切靈敏度:T7E1可檢測≥5%的編輯效率。

  • 驗證步驟:Sanger測序確認突變類型(如插入/缺失)。

(三)酶切與測序驗證技術(shù)
方法原理適用場景局限
T7E1酶切錯配切割產(chǎn)生異源雙鏈初篩(低成本)靈敏度低(≥5%編輯率)
Sanger測序直接讀取序列變異單克隆驗證通量低
高通量測序深度覆蓋靶位點突變多基因/脫靶分析成本高

操作優(yōu)化

  • 混合克隆預(yù)篩:FA-PCR檢測群體編輯率,>30%時再分選單克隆。

     
  • 雙驗證策略:T7E1初篩陽性克隆 → Sanger測序確認(避免假陽性)。


三、技術(shù)選擇與場景適配

(一)按細胞類型選擇
細胞類型推薦方法理由
原代細胞微量細胞鑒定法避免長期培養(yǎng)致老化(豬成纖維細胞)
腫瘤細胞系抗生素篩選 + FACS增殖快,耐藥性穩(wěn)定
iPSCsHDR報告系統(tǒng) + 單克隆測序維持多能性,需高精度編輯
(二)按編輯類型選擇
編輯類型篩選技術(shù)關(guān)鍵指標(biāo)
基因敲除(KO)NHEJ-GFP報告系統(tǒng)GFP?細胞占比(流式定量)
基因敲入(KI)抗生素篩選 + PCR驗證抗性存活率 + 側(cè)翼序列擴增
點突變(PM)T7E1 + 深度測序突變頻率>90%


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