詳細介紹
陽性細胞篩選是基因編輯的核心環節,其效率直接影響實驗周期與成功率。
核心目標
從混合細胞群中分離成功編輯的細胞(如基因敲除/KO、敲入/KI)。
排除野生型細胞干擾(未編輯細胞占比高時,易導致假陰性)。
關鍵挑戰
細胞損傷:長期篩選導致細胞老化(豬成纖維細胞傳代后增殖能力驟降)。
假陽性風險:部分編輯未wan全破壞基因功能(如移碼突變未致功能喪失)。
通量瓶頸:傳統單克隆培養需22天以上,且陽性率不足20%。
利用修復機制觸發熒光/抗性標記表達,實現可視化和快速分選:
修復機制 | 報告系統設計 | 篩選方法 | 優勢 | 案例 |
---|---|---|---|---|
NHEJ | 靶向破壞熒光蛋白終止子→恢復表達 | FACS分選GFP?細胞 | 直觀高效,適用于KO | CRISPR-DIY載體 |
HDR | 同源重組插入抗性基因(如Puro?) | 抗生素壓力篩選 | 適合KI,成本低 | 碧云天CRISPR質粒 |
SSA | 斷裂誘導單鏈退火修復→熒光蛋白重構 | 流式細胞術 | 靈敏度高,脫靶率低 | 多重基因編輯驗證 |
操作流程(以NHEJ-GFP系統為例):
構建含GFP-TAA終止子的編輯載體(sgRNA靶向TAA區域)。
轉染細胞后,NHEJ修復破壞終止子→GFP表達。
72h后使用流式細胞儀(如iQue®)分選GFP?細胞。
突破性方案:僅需50個細胞即可完成基因型鑒定,縮短周期15天以上。
關鍵參數:
細胞量:≥50個(20細胞組檢出率不足,P<0.01)。
酶切靈敏度:T7E1可檢測≥5%的編輯效率。
驗證步驟:Sanger測序確認突變類型(如插入/缺失)。
方法 | 原理 | 適用場景 | 局限 |
---|---|---|---|
T7E1酶切 | 錯配切割產生異源雙鏈 | 初篩(低成本) | 靈敏度低(≥5%編輯率) |
Sanger測序 | 直接讀取序列變異 | 單克隆驗證 | 通量低 |
高通量測序 | 深度覆蓋靶位點突變 | 多基因/脫靶分析 | 成本高 |
操作優化:
混合克隆預篩:FA-PCR檢測群體編輯率,>30%時再分選單克隆。
雙驗證策略:T7E1初篩陽性克隆 → Sanger測序確認(避免假陽性)。
細胞類型 | 推薦方法 | 理由 |
---|---|---|
原代細胞 | 微量細胞鑒定法 | 避免長期培養致老化(豬成纖維細胞) |
腫瘤細胞系 | 抗生素篩選 + FACS | 增殖快,耐藥性穩定 |
iPSCs | HDR報告系統 + 單克隆測序 | 維持多能性,需高精度編輯 |
編輯類型 | 篩選技術 | 關鍵指標 |
---|---|---|
基因敲除(KO) | NHEJ-GFP報告系統 | GFP?細胞占比(流式定量) |
基因敲入(KI) | 抗生素篩選 + PCR驗證 | 抗性存活率 + 側翼序列擴增 |
點突變(PM) | T7E1 + 深度測序 | 突變頻率>90% |
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